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并持续至胚胎着床(GD6-GD7) 2.3 阴道涂片检查:


发布者:黄金赌城 日期:2021-01-26 13:19


  生殖毒性试验流程及意义_医药卫生_专业资料。啮齿类动物生殖毒性 I、II、III 段实验流程及意义 、 、 1.概述 概述 生殖毒性试验(Reproductive toxicity study)是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生 殖功能和发

  啮齿类动物生殖毒性 I、II、III 段实验流程及意义 、 、 1.概述 概述 生殖毒性试验(Reproductive toxicity study)是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生 殖功能和发育过程的影响,预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代 生殖机能的不良影响,以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。包括:生育力 与早期胚胎发育毒性实验(I 段) 、胚胎—胎仔发育毒性试验(II 段) 、围产期毒性试验(III 段) 。 生殖毒性试验中, 为方便实验一般可将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段如下图 所示: 图 1. 动物生命周期划分 A. 从交配前到受孕(成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育和成熟、交配行为、受精) 。 B. 从受孕到着床(成年雌性生殖功能、着床前发育、着床) 。 C. 从着床到硬腭闭合(成年雌性生殖功能、胚胎发育、主要器官形成) 。 D. 从硬腭闭合到妊娠终止(成年雌性生殖功能、胎仔发育和生长、器官发育和生长) 。 E. 从出生到离乳(成年雌性生殖功能、幼仔对宫外生活的适应性、离乳前发育和生长) 。 F. 从离乳到性成熟(离乳后发育和生长、独立生活的适应能力、达到性成熟的情况) 。 各段试验研究阶段如下: 各段试验研究阶段如下: 生育力与早期胚胎发育毒性实验(I 段) :A-B 胚胎—胎仔发育毒性试验(II 段) :C-D 围产期毒性试验(III 段) :C-F 1 一般试验设计简介 1.1 受试物 生殖毒性试验的受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品。 1.2 实验动物 首选啮齿类动物为大鼠。在胚胎-胎仔发育毒性研究中,一般还需要采用第二种哺乳动物, 家兔为优先选用的非啮齿类动物。 1 1.3 给药 1.3.1 计量选择:至少应设三个剂量组,必要时可增加剂量组。 高剂量:应出现一些轻微的母体毒性反应,或为最大给药量/最大耐受量。 高剂量 低剂量:应为生殖毒性方面的“未观察到不良反应的剂量(NOAEL)。 ” 低剂量 1.3.2 给药途径:给药途径应与临床拟用途径一致(不用腹腔注射途径,因腹腔注射会对胎 儿及子宫产生直接影响) 。 1.4 对照组 应设赋形剂对照组。当赋形剂可能产生作用或影响受试物的作用时,应另设空白对照组。 二、生育力与早期胚胎发育毒性试验(I 段) 生育力与早期胚胎发育毒性试验( 生育力与早期胚胎发育毒性试验是对雌雄动物由交配前到交配期直至胚胎着床给药, 以 评价受试物对动物生殖的毒性或干扰作用 (生殖细胞接触药物后对受胎能力、 生殖系统及子 代有无不良影响) 。 评价内容包括配子成熟度、交配行为、生育力、胚胎着床前阶段和着床等。研究阶段包 括生命周期的 A 阶段和 B 阶段如下图所示: 图 2. 生育力与早期胚胎发育毒性试验研究阶段示意图 注*:引自《生殖毒性发育试验设计和实施中应该注意的问题》,作者:常艳 * 1.试验流程如下图所示: 试验流程如下图所示: 试验流程如下图所示 图 3. 生育力与早期胚胎发育毒性试验流程图 2 2.试验流程图解: 试验流程图解: 试验流程图解 2.1 分组及饲养:首先雌鼠、雄鼠分别按体重随机分为给药组和对照组,常规饲养,每天观 察并记录动物体征和死亡情况; 2.2 给药期: 雄鼠: 雄鼠:交配前给药 4-10 周,给药期持续整个交配期,至处死; 雌鼠: ; 雌鼠:交配前两周开始给药,并持续至胚胎着床(GD6-GD7) 2.3 阴道涂片检查:合笼交配前 2 周须每天对雌鼠进行阴道涂片检查,观测每只雌鼠的性周 期变化,以检查其是否对交配和交配前时间有影响; 2.4 合笼:雌鼠、雄鼠 1:1 合笼交配,交配期 2 周。交配结束后雌鼠、雄鼠分别进行不同处 理: 雄鼠: 雄鼠:交配成功后即可处死,并进行剖检,保存睾丸、附睾、异常组织器官; 检测项目主要包括:附睾精子计数、精子活力检查、精子畸形检查; 统计项目:摄食量、体重、生育率; 雌鼠: 雌鼠:未交配成功的雌鼠:交配结束后处死; 交配成功孕鼠:每天观察并记录体征、死亡情况;每 3 天测定体重、摄食量;并于 GD13-GD15 日处死,进行剖检。保存子宫、卵巢及异常组织器官; 检测项目:计数黄体数、活胎、死胎、吸收胎数,并计算着床数; 统计项目:摄食量、体重、受孕率、妊娠率、着床前丢失率、着床后丢失率; 胎仔发育毒性试验( 三、胚胎-胎仔发育毒性试验(II 段) 胚胎 胎仔发育毒性试验 胚胎-胎仔发育毒性试验是研究妊娠动物自胚胎着床至硬腭闭合给药,评价药物对妊娠 动物、胚胎及胎仔发育的影响。实验动物包括大鼠和家兔。 评价内容包括妊娠动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、胚胎-胎仔死亡、生长改变和结 构变化等。研究阶段主要包括生命周期的 C 阶段至 D 阶段如下图所示: 图 4. 胚胎-胎仔发育毒性试验研究阶段示意图 注*:引自《生殖毒性发育试验设计和实施中应该注意的问题》,作者:常艳 * 1. 试验流程如下图所示: 试验流程如下图所示: 3 图 5. 胚胎-胎仔发育毒性试验流程图 2. 实验流程图解: 实验流程图解: 图解 2.1 制备孕鼠/孕兔,并按体重平均分为给药组和对照组,常规饲养,每 3 天测定摄食量、体 重;每天观察并记录体征、死亡情况; 2.1 给药期:给药期设定在怀孕动物胚胎着床至硬腭闭合期。孕鼠给药期:GD6-GD15;孕 兔给药期:GD6-GD18; 2.3 剖检: 动物饲养至分娩前处死, 剖腹取仔。 孕鼠剖检日期: GD20/GD21; 家兔剖检日期: GD28/GD29; 母鼠/母兔: 保存异常组织器官; 计数: 黄体数、 活胎、 母鼠 母兔: 母兔 进行大体尸检观察胎盘是否异常; 死胎、吸收胎;计算:摄食量、体重、着床数; 胎仔: 胎仔:胎仔清洗干净后分别测定每只胎仔体重、顶臀长,并进行大体外观检查。该过程 以后胎鼠与胎兔处理是有区别的。胎鼠:50%胎仔制作骨骼标本,进行骨骼检查;50% 胎仔制作内脏标本,进行内脏检查;胎兔:全部胎兔首先进行剖检,进行内脏检查,然 后将剖检后胎兔剥离皮肤组织, 并剔除脂肪, 全部制作成骨骼标本, 进行后期骨骼检查。 四、围产期毒性试验(III 段) 围产期毒性试验( 围产期毒性试验是检测从胚胎着床到幼仔离乳给药对妊娠/哺乳的雌性动物以及胚胎和 子代发育的不良影响; 评价内容包括妊娠动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、出生前和出生后子代死亡情况、 生长发育的改变以及子代的功能缺陷,包括 F1 代的行为、性成熟和生殖功能。研究阶段包 括生命周期中的 C 阶段至 F 阶段如下图所示: 图 6. 围产期毒性试验研究阶段示意图 4 * 注*:引自《生殖毒性发育试验设计和实施中应该注意的问题》 ,作者:常艳 1.试验流程如下图所示: 试验流程如下图所示: 试验流程如下图所示 图 7. 围产期毒性试验流程图 2.试验流程图解: 试验流程图解: 试验流程图解 2.1 制备孕鼠,按体重平均分为给药组和对照组,饲养至分娩,该阶段为怀孕期,每天对孕 鼠进行体征及死亡情况观察;每 3 天进行体重、摄食量测定; 2.1 给药期:设定在胚胎硬腭闭合至哺乳结束期,一般为孕鼠怀孕 15 日至子鼠离乳 (GD15-PND21)进行给药。 2.3 分娩:孕鼠一般于 GD21-GD23 分娩;在大鼠分娩结束后进行观察(不能打扰其分娩, 以免产生食仔现象) ,计数死胎数、活胎数、雌胎仔数和雄胎仔数;计算 F1 代大鼠畸形率、 成活率、性别比例;对胎鼠进行外观畸形检查,并分别测定每窝雌、雄胎仔总体重;后进入 哺乳阶段。 2.3 哺乳期:P 代大鼠:每天进行体征及死亡情况观察;每 3 天进行体重、摄食量测定,饲 代大鼠: 养至离乳; F1 代胎鼠:每天计数雌、雄胎鼠数量;每 3 天分别测定雌、雄胎鼠总体重;于 PND4 代胎鼠: 进行窝仔数调整(减少由于每窝胎仔数目不同而产生的对胎鼠身体发育等指标的影响) ;哺 乳期至离乳后还需根据身体发育、反射发育等检测指标日程安排对 F1 代胎鼠进行身体发育 检测和反射发育检测; 2.4 离乳: F1 代大鼠于 PND21 离乳,代表哺乳期结束。此时对 P 代雌鼠及 F1 代大鼠分别 5 进行相应处理: P 代大鼠:哺乳期结束后(PND21)进行大体剖检;保存:异常组织器官;统计摄食量、 体重、哺乳成活率; F1 代大鼠:每窝留存雌、雄仔鼠各 1 只,数量不够时同剂量组仔鼠补齐,饲养至性成 代大鼠: 熟。该阶段每天观察并记录 F1 代大鼠体征、死亡情况;每周测定摄食量、体重;据 F1 代 仔鼠行为指标检测日程安排进行转棒试验和穿梭箱试验。 2.5 F1 代大鼠合笼交配:F1 代大鼠性成熟后同剂量组雌鼠与雄鼠 1:1 配对,合笼交配,交 配期为 2 周。交配结束后对雄鼠、雌鼠分别进行相应处理: F1 代雄鼠 代雄鼠:处死,计算生育率; 未孕雌鼠:处死,并进行大体剖检,保存异常组织器官; 未孕雌鼠 孕鼠:饲养至胚胎硬腭闭合(GD13-GD15) ,怀孕期每天观察并记录 F1 代孕鼠体征、 孕鼠 死亡情况,每 3 天测定摄食量、体重; 2.6F1 代雌鼠于 GD13-GD15 处死,大体尸检,检查有无胎盘异常,保存异常组织器官;计 数黄体数、活胎、死胎、吸收胎数;计算摄食量、体重、妊娠率;活胎率、死胎率、着床前 丢失率、着床后丢失率; 6


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